Robust microbial construction and efficient processes for recombinant enzymes production in Escherichia coli

Encara que els gens de resistència a antibiòtics són una eina important per a la selecció i manteniment de plàsmids recombinants, les autoritats reguladores consideren el seu ús inacceptable en diverses àrees dins la indústria biotecnològica, sobretot quan el producte serà utilitzat amb finalitat terapèutica. Un sistema d'expressió basat en el vector pQE (Quiagen) amb un marcador de selecció plasmídic alternatiu (basat en l'auxotròfia de glicina) va ser desenvolupat prèviament (Vidal et al., 2008). El sistema d'expressió pQE es basa en el promotor T5, induïble per IPTG. La no-­- estabilitat del promotor en absència d'inductor pot provocar una inestabilitat estructural del vector, que portarà a nivells baixos d'expressió deguts, per exemple, a fenòmens de recombinació a la regió del promotor T5. El repressor lac, codificat pel gen lacI, s'uneix molt fortament al promotor, interferint en la transcripció del gen d'interès. Així doncs, els nivells transcripcionals del gen lacI tenen un paper crític en els sistemes d'expressió basats en el promotor T5, influenciant els nivells basals de transcripció i la concentració d'inductor. Encara que la sobreexpressió de la proteïna d'interès és un factor important en quant a càrrega metabòlica, també cal tenir en compte la contribució deguda a l'expressió d'altres gens plasmídics. En aquest sentit, per tal de millorar la robustesa del sistema i minimitzar la càrrega metabòlica relacionada amb els gens codificats als plàsmids, s'han eliminat tots els gens de resistència a antibiòtics i s'han afinat els nivells d'expressió del marcador auxotròfic (glyA) i del repressor lac (lacI). En aquest treball s'han construït uns cassettes d'expressió on els gens lacI i glyA estan sota el control d'un seguit de promotors constituents sintètics, per tal d'obtenir suficient inhibidor lacI per evitar la "no-­-estabilitat del promotor" i assegurar el nivell mínim de transcripció de glyA necessaris tant per al manteniment del plàsmid com per al correcte creixement del cultiu en medi definit. A més, el gen de resistència a antibiòtic en el vector d'expressió va ser reemplaçat per la construcció glyA-­-lacI, obtenint un sistema totalment lliure de gens per a la resistència a antibiòtic. Finalment, s'ha estudiat la capacitat per a la sobreexpressió de FucA recombinant a diferents escales (flascons agitats i bioreactor) i en diversos modes d'operació (discontinu i discontinu alimentat) per tal d'obtenir alts nivells d'expressió. Per últim, per tal d'analitzar la població bacteriana a nivell de cèl·∙lules individuals, els canvis morfològics (FSC i SSC) i les característiques físiques i bioquímiques de les diferents cèl·∙lules dins la població bacteriana, s'han realitzat anàlisis de citometria de fluxWhile antibiotic resistance marker genes are a powerful system for selection and maintenance of recombinant plasmids in hosts such as E. coli, its use has been considered unacceptable in many areas of biotechnology by regulatory authorities, particularly when the recombinant product will be used in the therapeutic field. Previously, we have developed an expression system based on the pQE vector series (Qiagen) with an alternative plasmid selection marker based on glycine auxotrophy complementation (Vidal et al., 2008). The pQE expression system is based on the IPTG-­-induced T5 promoter. Promoter leakiness in inducer absence may lead to structural instability of the expression vector, resulting in reduced expression levels, e.g. due to recombination events in the T5 promoter region. The lac repressor, encoded by the lacI gene, binds very tightly to the promoter, interfering with the transcription of the gene of interest. Therefore, lacI transcriptional level plays a key role in T5 promoter-­-based expression systems, influencing the basal transcriptional levels and the concentration of inducer. Furthermore, although the overexpression of the plasmid-­-encoded protein of interest is a major factor in the metabolic burden, expression of other plasmid-­-genes may also contribute. Thus, in order to improve the system robustness, all the antibiotic resistance genes have been removed and the expression levels of the auxotrophic marker (glyA) and the lac repressor (lacI) genes have been fine-­-tuned, in order to minimize the metabolic burden related to plasmid-­-encoded genes. In this study, an expression cassette has been constructed where the lacI and glyA genes have been placed under the control of selected synthetic constitutive promoters in order to obtain the sufficient lacI inhibitor ensuring lack of "promoter leakiness" and the minimal glyA transcriptional levels needed for plasmid maintenance and optimal cell growth in defined media. Moreover, in the expression vector the antibiotic resistance gene was replaced by the lacI-­-glyA cassette, thus yielding a completely antibiotic resistance gene free system. Finally, in order to obtain high expression levels of the protein of interest, the capacity for recombinant FucA overexpression has been investigated at different scales (shake flasks and bioreactors) and operation modes, batch and fed-­-batch. Lastly, flow cytometry analyses were performed in order to analyze the bacterial populations at the single-­-cell level: changes in morphology (FSC and SSC) and physical and biochemical characteristics of individual cells within a bacterial population

Inmovilización de transaminasas y amonio liasas y su aplicación en síntesis de compuestos aminados

El objetivo del presente trabajo de tesis es establecer métodos biocatalíticos para la síntesis de los aminoácidos L-fenilalanina, L-aspartato, β−aminobutirato y de las aminas aromáticas 1-feniletilamina y 3-amino-1-fenilbutano, usando biocatalizadores con actividad transaminasa y amonio liasa inmovilizados por técnicas de formación de enlaces covalentes (en el caso de enzimas) y por atrapamiento (tanto para enzimas como para células). Se establecieron dos métodos enzimáticos para la síntesis del aminoácido aromático esencial L-fenilalanina (Phe). El primer método de síntesis se realizó usando como biocatalizador L-aspartato transaminasa (13T) de corazón porcino inmovilizado. Se optimizaron los métodos de inmovilización de 13T en los soportes Eupergit® C, MANA-agarosa y LentiKats®. Los biocatalizadores inmovilizados resultantes se emplearon en la síntesis de Phe. La inmovilización en Eupergit® C y LentiKats® permitió mejorar la estabilidad del enzima 13T, así como alcanzar rendimientos de reacción de síntesis de Phe superiores al 70%. Además se estableció un método de síntesis multienzimática "one-pot", para lo que se acoplaron las reacciones catalizadas por los enzimas aspartasa (AspB) y transaminasa (AT). Se determinó la compatibilidad de los enzimas en las condiciones de reacción (pH 7,5 y 37°C) y se establecieron las concentraciones óptimas de los sustratos (0,15 M de fumarato, 0,3 M de NH4Cl y 0,1 M de fenilpiruvato) y de los enzimas (0,3 U de AspB/mL y 2 U de AT/mL). En estas condiciones, se alcanzó un rendimiento global de reacción de 80%. Para la síntesis de L-aspartato (Asp) se utilizó el enzima L-aspartato amonio liasa o aspartasa (AspB) de Bacillus sp. YM55-1 parcialmente purificado. El enzima se inmovilizó en los soportes Eupergit® C, MANA-agarosa y LentiKats®. Los biocatalizadores inmovilizados se emplearon en la síntesis de altas concentraciones de Asp (≥ 60 g/L). Además, el enzima inmovilizado se reutilizó eficientemente en la síntesis del aminoácido, manteniendo alrededor del 90% de su actividad inicial al cabo de 5 ciclos de reacción en todos los casos. La síntesis de las aminas aromáticas 1-feniletilamina (FEA) y 3-amino-1-fenilbutano (AFB) se llevó a cabo utilizando biocatalizadores (células y/o enzima parcialmente purificado) con actividad ω−transaminasa (ω−TA). Se estableció un método de permeabilización de las membranas de células ω−TA utilizando bromuro de cetrimonio (CTAB). Las células ω−TA se inmovilizaron en el soporte LentiKats® con un 100% de retención de su actividad catalítica. El enzima ω−TA se inmovilizó en varios soportes, obteniéndose los mejores resultados en Eupergit® CM y LentiKats®. La inmovilización en LentiKats®, tanto de células (no permeabilizadas y permeabilizadas) como del enzima, permitió la reutilización de los catalizadores hasta en 5 y 10 ciclos de síntesis de AFB, manteniendo alrededor del 80 y 70% de la actividad inicial, respectivamente. Por último, se comprobó que el enzima aspartasa mutado (AspB-C6) a partir de AspB, cataliza la reacción de aminación regioselectiva del ácido crotónico para producir β−aminobutirato. Este enzima se inmovilizó en los soportes Eupergit® C y MANA-agarosa según los métodos de inmovilización establecidos para el enzima AspB en los mismos soportes. Se obtuvieron rendimientos de inmovilización similares pero las actividades retenidas fueron significativamente inferiores para AspB-C6 que para AspB.The objective of this thesis is to establish biocatalytic methods for the synthesis of the amino acids L-aspartate, L-phenylalanine and β−aminobutyrate, as well as the aromatic amines 1-phenylethylamine and 3-amine-1-phenylbutane, by using biocatalysts with transaminase and ammonia-lyase activity immobilized by covalent attachment techniques (for enzymes) and entrapment (for enzymes and cells). Two methods for the synthesis of the essential aromatic amino acid L-phenylalanine (Phe) were established. The first method was carried out by using L-aspartate transaminase (AAT) from porcine heart as biocatalyst. The immobilization of the enzyme AAT on Eupergit® C, MANA-agarose and LentiKats® supports was optimized, and the three immobilized enzymatic derivatives were used for the synthesis of Phe. AAT immobilized on Eupergit® C and LentiKats® allowed improving the stability of the enzyme as well as reaching reaction yields of Phe over 70%. Moreover, a multi-enzymatic one-pot method for the synthesis of Phe was established by coupling of two consecutive enzymatic reactions catalyzed by aspartase (AspB) and transaminase (AT). The compatibility of both enzymes under the reaction conditions (pH 7,5 and 37°C) was shown; and, the optimum concentration of substrates (0,15 M fumarate, 0,3 M NH4Cl and 0,1 M phenylpyruvate) and enzymes (0,3 U of AspB/mL and 2 U of AT/mL) were established. In these conditions, the global reaction yield was 80%. L-aspartate was synthesized by using the enzyme L-aspartate ammonia-lyase or aspartase (AspB) from Bacillus sp. YM55-1. The enzyme was immobilized on Eupergit® C, MANA-agarose and LentiKats® supports. The immobilized biocatalysts were used for the synthesis of highly concentrated Asp (≥ 60 g/L). Furthermore, the immobilized biocatalysts were efficiently reused in 5 cycles of Asp synthesis, maintaining over 90% of activity and reaching over 90% of conversion in all the cases. The synthesis of the aromatic amine 3-amine-phenylbutane (APB) was carried out by means of cells with ω−transaminase (ω−TA) activity as well as the partially purified enzyme ω−TA. A permeabilization method of the cell membranes with cetrimonium bromide (CTAB) was performed. Cells were immobilized in LentiKats® with 100% retention of the catalytic activity. The enzyme ω−TA was immobilized on several supports, and the best results were obtained with Eupergit® CM and LentiKats® supports. The cells (non-permeabilized and permeabilized) and the enzyme immobilized in LentiKats®, allowed reusing the biocatalysts up to 5 and 10 cycles of synthesis of APB, maintaining around 80 and 70% of the initial activity respectively. Finally, it was shown that the mutated aspartase (AspB-C6) from AspB, catalyzes the regioselective amination of crotonic acid to yield β−aminobutyrate. This enzyme was immobilized on Eupergit® C and MANA-agarose supports, according to the immobilization methods established for AspB on the same supports. The immobilization yields were similar; however the retained activities were lower than those obtained for AspB

Monitorización de la diversidad microbiana en biofiltros percoladores mediante pirosecuenciación tag-454 y optimización de protocolos para hibridación con fluorescencia in situ (FISH)

La biofiltración ha demostrado ser una tecnología exitosa para la eliminación del H2S y del NH3 de las corrientes de gases contaminadas. El tema asume relevancia pues se establece como tecnología limpia y sostenible. Debido a su organización los biofiltros son considerados ecosistemas artificiales complejos en donde las variables ambientales y la composición de la comunidad están estrictamente relacionadas y de ellas depende el éxito del proceso. La diversidad de bacterias y la dinámica de la comunidad son elementos importantes del componente biológico aunque su conocimiento es aún muy limitado. Para comprenderlo mejor se necesitan perfiles poblacionales elaborados mediante herramientas de biología molecular tales como la pirosecuenciación e hibridación con fluorescencia in situ (FISH). Este fue el eje temático de la presente tesis: Estudiar la composición y la dinámica de comunidades de Eubacteria de biofiltros percoladores mediante pirosecuenciación 454-Roche (tag-454). También se procedió a optimización de protocolos FISH. Para ambas herramientas se evaluó la cobertura de la diversidad y su efectividad para el estudio y seguimiento del componente biológico.Se estudiaron dos sistemas de desulfuración de biogás, uno aerobio y otro anóxico, y un tercer sistema de tratamiento de corrientes ricas en NH3. Los resultados obtenidos demostraron que la comunidad fue capaz de sostenerse bajo las condiciones de operación probadas. En el biofiltro de desulfuración aerobia ocurrió un cambio drástico en la composición de la microbiota en función de la acidificación del medio (pH; 7-2.5), y que la pérdida de diversidad fue compensada por la eficacia de las poblaciones acidófilas. En el biofiltro anóxico los cambios poblacionales no afectaron, en general, en el rendimiento de la desulfuración del biogas, y la actividad de Sedimenticola fue determinante para el éxito del sistema. En el biofiltro percolador de NH3 se comprobó los efectos combinados de tiempos de residencia con diferentes concentraciones de entrada del gas. Las alteraciones en dichos parámetros produjeron cambios significativos en la comunidad nitrificante. Las condiciones favorecieron el crecimiento de Comamonas, Nitrosomonas (AOB) y Nitrobacter (NOB). Fue interesante encontrar una presencia marcada de bacterias desnitrificantes, cosa que no perjudicó al rendimiento de la nitrificación. En los estudios con tag-454 se encontró dificultad a la hora de asignar identidad a secuencias, lo que se justificó por la longitud insuficiente de los fragmentos y por la falta de cobertura de las bases de datos. De todos modos los resultados indicaron que la diversidad fue representada adecuadamente, permitiendo una cobertura muy buena de las distintas comunidades hecho que corrobora la efectividad de la aproximación. El trabajo de optimización de la FISH se enmarca en el conocimiento previo de la diversidad microbiológica a la hora de elegir sondas y se comprobó la influencia de la autofluorescencia del S0 sobre el recuento de células. Los resultados mostraron que la elección de los fluorocromos fue fundamental para eliminar la autofluorescencia de las partículas de S0 que originaban datos sobre-estimados de abundancia relativaBiofiltration has proved to be a successful technology for removal of H2S and NH3 from the contaminated gases. The subject assumes significance as it is established as a clean and sustainable technology. Due to its organization biofilters are considered complex artificial ecosystems, where environmental variables and community composition are strictly related and on them depends the success of the process. The bacterial diversity and community dynamics are very important elements of the biological component, but their knowledge is still very limited. To better understand it, populational profiles elaborated by tools such as molecular biology and genomic DNA pyrosequencing of fluorescence in situ hybridization (FISH) are required. This was the theme of this thesis: To study the composition and dynamics of Eubacteria communities in three trickling biofilters using the 454-Roche (tag-454). FISH protocols were also optimized. Two systems of biogas desulphurization were studied, one aerobic and one anoxic, plus a third system for treatment of currents rich in NH3 . The acquired results showed the ability of the community to sustain itself under the tested operational conditions. In the aerobic biofilter desulfurization it occurred a drastic change in the composition of the microbiota in terms of environmental acidification; (pH; 7-2.5), and that biodiversity loss was offset by the effectiveness of acidophilic populations. In the anoxic biofilter, changes did not affect the population in general, the performance of biogas desulfurization and Sedimenticola activity was crucial to the success of the anoxic desulfurization. In the NH3 trickling biofilter, it was proved the combined effects of residence time and different concentrations of gas entrance. Alterations in said parameters produced meaningful changes in the nitrifying community. The resulting conditions favored the growth of the Comamonas, Nitrosomonas (AOB) and Nitrobacter (NOB). It was interesting to find a strong presence of denitrifying bacteria, which did not affect the nitrification performance. In studies using tag-454, the difficulty of assigning identity to the readings of some of the found sequences, which was justified by the insufficient length of the fragments and the lack of databases coverage. Regardless, the results indicated that the diversity represented the 95% of similarity, and in the end there was a very good coverage of different communities. The relative abundance data allowed the explanation of the dynamics of said communities, fact that corroborates the approximation's efficiency. The optimization of work by FISH relays in prior knowledge of microbial diversity when choosing probes, and proved the influence of the S0 autofluorescence over the cell count. The results showed that the choice of fluorochromes was fundamental to eliminate the autofluorescence of S0 particles that originated over-estimated data of relative abundance

Systematic metabolic analysis of recombinant Pichia pastoris under different oxygen conditions : a metabolome and fluxome based study /

L'anàlisi sistemàtic de la fisiologia cel·lular és de gran importància en la millora del coneixement sobre els microorganismes. En aquesta direcció, la biologia de sistemes ens permet l'anàlisi quantitatiu de diferents nivells fisiològics obtenint representacions in silico de les vies metabòliques estudiades que, en conjunt, s'adrecen a la millor comprensió del comportament de sistemes biològics complexos. Aquest projecte de recerca va ser dissenyat per contribuir en la comprensió de la fisiologia de Pichia pastoris sota diferents condicions d'estrès. Específicament, aquesta tesis se centre en l'estudi sistemàtic del conjunt de metabòlits lliures dins la cèl·lula i en la velocitat que aquests es transformen. En el Capítol 2, una caracterització dels principals component de la biomassa de P. pastoris es va realitzadar sota diferents condicions de. Per una altre part, la consistència dels fluxos dels metabòlits extracel·lulars van ser utilitzats per identificar la producció d'un subproducte de fermentació, arabinitol. En el Capítol 3, s'obtingué la relació entre diferents fluxos metabòlics del metabolisme central del carboni de P. pastoris mitjançant l'estudi del carboni marcat dels aminoàcids sintetitzats de novo. Posteriorment, aquest valors van ser utilitzats delimitant l'anàlisi de fluxos metabòlics sota diferents condicions d'oxigenació i producció de proteïna recombinant. Els resultat més destacats obtinguts foren la gran similitud entre els fluxos estimats per les soques productora i control en condicions equivalents. Tot i així, diferencies clares van ser observades quan es van comparar el patró de fluxos corresponents a diferents nivells d'oxigenació. L'anàlisi dels metabòlits lliures dins la cèl·lula va començar en el Capítol 4 amb l'avaluació sistemàtica de cinc protocols de parada ràpida del metabolisme en P. pastoris respecte la concentració de metanol i la temperatura. Com a resultat, la parada del metabolisme realitzada a -27ºC amb una solució de 60% v/v de metanol a ser amb la que menys pèrdues es van observar. Consecutivament, es va demostrar que cinc temps de residència són els necessaris per arribar a un estat estacionari del metabòlits intracel·lulars en cultius amb glucosa limitant. D'altra banda, sota les mateixes condicions de treball, els perfils intracel·lulars dels principals metabòlits eren similars entre els llevats P. pastoris i S. cerevisiae. En el Capítol 5, l'estequiometria redox i energètica de P. pastoris va ser validada veient un augment en els requeriments energètics d'aquesta sota condicions deficitàries d'oxigen. A més a més, es va realitzar un anàlisi termodinàmic dels metabòlits intracel·lulars mitjançant lo qual s'obtingueren millores en el patró de fluxos en la via de les pentoses fosfat conjuntament amb informació de l'estat redox del citosol. En el Capítol 6, la regulació transcripcional i termodinàmica dels fluxes del metabolisme central del carboni va ser investigada entre diferents condicions de cultiu. En general, la contribució dels diferents nivells omics en el canvi final dels fluxos metabòlics van resultar ser diferents entre els llevats P. pastoris i S. cerevisiae. Específicament, per P. pastoris, la regulació transcripcional va ser significant en la majoria de reaccions, contràriament al que s'havia descrit per S. cerevisiae. Finalment, en el Capítol 7, per una millor comprensió de l'efecte i la interacció de la disponibilitat d'oxigen i la producció d'una proteïna forania, es va realitzar un anàlisi quantitatiu del aminoàcids lliures intracel·lulars sota la producció d'aquesta proteïna i en diferents condicions d'oxigenació. Els valors obtinguts indicaren una variació significativa d'aquests aminoàcids intracel·lulars entre diferents disponibilitats d'oxigen. Sorprenentment, l'expressió d'aquesta es va veure que tenia un impacte limitat, però significant, en els pools d'aminoàcids. Amb tot, els canvis individuals observats no presentaven una correlació amb l'abundància relativa d'aquests en la proteïna recombinant, en canvi, concordava amb la variació de la composició aminoacídica de la biomassa. 90%) were obtained for all quenching procedures tested. However, quenching at -27ºC in 60% v/v methanol performed slightly better in terms of leakage minimization. Thereafter, it was demonstrated that five residence times under glucose limitation were enough to reach stable intracellular metabolite pools. Moreover, when comparing P. pastoris and S. cerevisiae metabolomes, under the same cultivation conditions, similar metabolite fingerprints were found in both yeasts, except for the lower glycolysis. In Chapter 5, the redox and energy stoichiometry of P. pastoris was validated showing increasing energy requirements as the oxygen availability became shortage. In addition, a network-embedded thermodynamic analysis of the quantitative intracellular metabolites pools was performed allowing an improvement of the non-oxidative pentose phosphate pathway fluxes as well as determination of the oxygen impact over the redox state of the cytosol. In Chapter 6, the transcriptional and thermodynamic regulations over the metabolic flow between conditions were investigated for the central carbon metabolism reactions. Overall, the different omic contributions to the final metabolic flux changes were resulted to be different between P. pastoris and S. cerevisae. Specifically, for P. pastoris, transcriptional regulation was found to be in most cases significant, contrarily to the baker yeast. Finally, in Chapter 7, to better understand the effect and interplay of oxygen availability and foreign protein secretion on central metabolism, a first quantitative metabolomic analysis of free amino acids pools in a recombinant P. pastoris strain growing under different oxygen availability conditions was performed. The values obtained indicated significant variations in the intracellular amino acid levels due to different oxygen availability conditions. Notably, even that foreign protein productivities were relatively low, recombinant protein production was found to have a limited but significant impact. However, observed changes in individual amino acids pools were not correlated with their corresponding relative abundance in the recombinant protein sequence, but to the overall cell protein amino acid compositional variations

Producción de eritrocitos a partir de células CD34⁺ de sangre de cordón umbilical

El objetivo de este estudio es la generación ex-vivo de eritrocitos a partir de la maduración y diferenciación de células CD34+ purificadas de sangre de cordón umbilical. El desarrollo de la terapia celular y la generación de diferentes tipos celulares a partir de células madre ha abierto el campo a la producción de diferentes componentes sanguíneos, entre ellos los eritrocitos, a partir de células madre hematopoyéticas (células CD34+). Existen diferentes fuentes de células CD34+, siendo el cordón umbilical una fuente de fácil acceso y donde éstas presentan una mayor capacidad de expansión. La necesidad de incrementar la tasa de expansión y el paso de enucleación celular son los puntos clave para hacer realidad la posibilidad de generar sangre en el laboratorio que sea equiparable a una unidad de sangre donada. Se han diseñado diferentes estrategias para generar eritrocitos a partir de células CD34+ de sangre de cordón umbilical. Estas estrategias se han basado en la utilización de diferentes medios de cultivo, citocinas, concentraciones celulares y estrategias de cultivo. Para el paso final de enucleación se ha pasado de un co-cultivo sobre capa estromal de células mesenquimales a un cultivo en suspensión celular. Se ha puesto a punto una metodología de cultivo consistente en la combinación de un medio específico con estrategias de alimentación que permiten la expansión y diferenciación de células CD34+ de cordón umbilical a eritrocitos maduros. Todavía son necesarios más ajustes para incrementar la tasa de expansión y optimizar la fase de maduración final.The aim of this study was the in vitro generation of red blood cells (RBC) from CD34+ cells purified from human umbilical cord blood, offering an alternative to classical transfusion products. Within the hematopoietic stem cell sources, umbilical cord is readily available and it has a greater expansion capacity. Such increase of the expansion capacity and the terminal differentiation efficiency are the key points in the generation of blood in the laboratory. We have tested different methodologies to generate erythrocytes from CD34+ cells from human umbilical cord blood. The parameters investigated related with the increase of the expansion capacity involved the use of different culture media, cytokines, cell seeding density and dilution steps. For the terminal differentiation and enucleation steps, the stromal layer co-culture was switched into a suspension culture with erythropoietin. The erythroid progenitors were characterized by the expression of the surface markers CD45, CD36, CD235 (glycophorin A) and CD71 (transferrin receptor). Enucleated cells were discriminated from nucleated cells by labeling the genetic content. May-Grünwald-Giemsa staining was used for morphological analyses. A culture methodology that combines a specific medium formulation and feeding strategy has been successfully developed in bioreactors allowing the expansion and differentiation of CD34+ cord blood to mature red blood cells. Further improvements are still needed in order to increase the expansion rate and to optimize terminal differentiation step

Resource metabolism of the construction sector : an application of material and exergy flow analysis

Ésta tesis tiene como objetivo evaluar el consumo de recursos del sector de la construcción, los residuos y las emisiones generadas por el sector. Ésto está motivado por el hecho de que el sector de la construcción es responsable de una gran cantidad de consumo de recursos y representa casi el 9% el valor bruto añadido al producto interno bruto del mundo. La evaluación considera la perspectiva del ciclo de vida, desde la extracción de materias primas, a través de la construcción y fabricación de productos, materiales de transporte, la construcción, la generación de residuos de demolición, el transporte de residuos, el tratamiento y disposición final. El objetivo es identificar las oportunidades y mejorar los criterios de selección de materiales, el procesado, la reutilización y el reciclado para el uso sostenible de los recursos. Debido a la complejidad de los sistemas de edificios e infraestructuras, compuestas de muchos componentes que interactúan, siempre es difícil llevar a cabo una contabilidad de los recursos precisos dentro de éste sector. En esta perspectiva, el concepto de análisis de flujo de materiales y la evaluación del ciclo de vida (ACV), y el análisis de exergía se tratan como herramientas de contabilidad de recursos y se centra en sus aplicaciones en el sector de la construcción. Además del análisis sectorial, ésta tesis, también analiza la eficiencia de los procesos de fabricación y el ciclo de vida completo de los productos con base a exergía. Todos los procesos y los productos seleccionados son relevantes para el sector de la construcción, y éste análisis tiene como objetivo proporcionar conocimientos de despersonalización en el uso de materiales del sector. En el capítulo 1, se expone el marco teórico en que los análisis de flujo de exergía y los materiales se utilizan en la evaluación del metabolismo de los recursos del sector de la construcción, que destacan la importancia de éste sector en términos de flujos de recursos y la generación de residuos y emisiones. Éste capítulo, también introduce la eficiencia exérgica y herramientas de evaluación del ciclo de vida exergéticos, que explica las limitaciones del análisis de la energía y el ACV, y cómo la aplicación de éstos métodos a base de exergía puede ofrecer mejores perspectivas sobre la eficiencia del uso de los recursos en los procesos de fabricación en toda la vida de los productos, respectivamente. La Ecología Industrial, se presenta al introducir el enfoque basado en los sistemas y el marco termodinámico en el que el sector de la construcción se analiza en este estudio. El capítulo 2, presenta los resultados de los análisis de flujo de materiales y exergía del sector de la construcción catalana en el año 2001. En ese momento, Cataluña tenía un adicional de 52 millones de toneladas de existencias de materiales para el sector y generaba 7 millones de toneladas de residuos de construcción y demolición, de los cuales sólo el 6,5% son recicladas o regeneradas. El estudio muestra que la fase de fabricación consume la mayor parte de los recursos de energía durante el ciclo de vida del conjunto de los productos, seguidos de transporte de materiales, que representa el 57% y el 4% del consumo de exergía, respectivamente. Se señala que la mejora en la selección de materiales, tecnologías de fabricación y diseño para el desmontaje, conduce a la sostenibilidad del sector, para conseguir una mejora de la eficiencia del uso de recursos. En el capítulo 3, se menciona el rendimiento exergético de los procesos de producción, tanto en el proceso de producción primaria como secundaria (reciclaje), de los materiales de construcción que se calcula, con el fin de evaluar la calidad de los materiales, las pérdidas de exergía, y el potencial de mejora de procesos. Ésto sirve para cuantificar el potencial de mejora de los procesos de fabricación actuales que abordan las deficiencias de fabricación de los nueve principales materiales de construcción no renovables: aluminio, acero, cobre, cemento, hormigón, cerámica, vidrio, polipropileno y cloruro de polivinilo. La Eficiencia Exergía basada en la segunda ley de la termodinámica es determinada con el fin de comparar la eficiencia exergía teórica y la eficiencia exergía del proceso real. La gran diferencia entre los requisitos teóricos y empíricos de exergía en los procesos de fabricación sugiere que las oportunidades para una mejor utilización de exergía industrial todavía existen, pero requieren un diseño y mejoras en la tecnología. Los resultados demuestran que los recursos se utilizan de manera más eficiente en los procesos de reciclaje, en comparación con los procesos de fabricación primaria. En esta tesis se presenta una teoría (capítulo 4) para determinar como de eficientemente se utilizan los recursos en las aplicaciones de la construcción, utilizando la metodología de análisis del ciclo de vida exergético desde un enfoque universal. Esto incluye la extracción de materias primas, la fabricación de resina y de gestión de las etapas del ciclo de vida de los residuos al final de su vida. La irreversibilidad durante el ciclo de vida completo permite evaluar el grado de perfección termodinámica de los procesos de producción y llevar a cabo la evaluación de la cadena de producción entera. Ciclo de vida global de la eficiencia exérgica de polipropileno y cloruro de polivinilo se cuantifica en 27,1% y 9,3%, respectivamente, que se caracteriza por una baja eficiencia en la fabricación y los procesos de reciclaje para ambos materiales. Desde el punto de vista de la conservación de recursos, el reciclado mecánico se ha sugerido como la opción viable para la gestión de residuos de plástico al final de su vida, ya que los materiales de bucles vuelven a su ciclo de vida original y reduce las aportaciones de recursos primarios en la producción.This thesis aims to assess the resource consumption of the construction sector, and the wastes and emissions generated by the sector. This is motivated by the fact that the construction sector is responsible for large amounts of resource consumption and represents nearly 9% gross value added to the world's gross domestic product. The assessment considers the life cycle perspective from raw material extraction, through construction product manufacturing, material transport, construction and demolition waste generation, to waste transport, treatment, and final disposal. The aim is to pinpoint the opportunities for improved material selection criteria, processing, reuse, and recycling for sustainable resource use. Due to the system complexity of buildings and infrastructure, composed of many interacting components, it is always challenging to undertake an accurate resource accounting within this sector. In this perspective, the concepts of material flow analysis (MFA), life cycle assessment (LCA), and exergy analysis (ExA) are discussed as resource accounting tools focusing on their applications in the construction sector. Apart from sectoral analysis, this thesis also analyzes the efficiency of manufacturing processes and products' complete life cycle based on exergy. All the processes and products selected are relevant for the construction sector, and this analysis aims to provide deper insights into sectoral material use. Chapter 1 details the theoretical framework under which exergy and material flow analyses are used in assessing the resource metabolism of the construction sector highlighting the importance of this sector in terms of resource flows, and generation of waste and emissions. This chapter also introduces the exergy efficiency and exergetic life cycle assessment (ELCA) tools, explaining the limitations of energy analysis and LCA, and how the application of these exergy-based methods can provide better insights into resource use efficiency in manufacturing processes and throughout the products' life, respectively. Industrial ecology (IE) is presented to introduce the systems-based approach and thermodynamic framework on which of the construction sector is analyzed in this study. Chapter 2 presents the results of material and exergy flow analyses of the Catalan construction sector for the year 2001. In 2001, Catalonia had an additional 52 million tonnes of material stock to the sector and generated 7 million tonnes of construction and demolition waste (CDW) of which only 6.5% were recycled or reclaimed. The study shows that manufacturing stage consumes the largest fraction of energy resources during the products' whole lifecycle followed by material transport, accounting for 57% and 4% of exergy use, respectively. It is pointed out that improvement in material selection, manufacturing technologies, and design for disassembly lead to sustainability of the sector delivering improved resource use efficiency. In chapter 3, the exergetic efficiency of the production processes, both primary and secondary (recycling) production process, of construction materials is calculated in order to assess material quality, exergy losses, and process improvement potentials. This serves to quantify the improvement potentials for present manufacturing processes addressing the manufacturing inefficiencies of nine major non-renewable construction materials: aluminum, steel, copper, cement, concrete, ceramic, glass, polypropylene (PP), and polyvinyl chloride (PVC). Exergy efficiency based on the second law of thermodynamics is determined in order to compare the theoretical exergy efficiency and the real-process exergy efficiency. The large difference between theoretical and empirical exergy requirements in manufacturing processes suggests that opportunities for better industrial exergy utilization still exist but require design and/or technology improvements. The results demonstrate that resources are utilized more efficiently in recycling processes compared to primary manufacturing processes. This thesis has presented an effort (chapter 4) to pinpoint how efficiently resources are used in the construction applications, using exergetic life cycle assessment methodology in a cradle-to-grave life cycle approach. This included raw material extraction, resin manufacturing, and end-of-life waste management life-cycle stages. The irreversibility during the complete life cycle allows to evaluate the degree of thermodynamic perfection of the production processes and to conduct the assessment of the whole process chain. Overall life cycle exergy efficiency of PP and PVC is quantified 27.1% and 9.3%, respectively, characterized by a low efficiency of manufacturing and recycling processes for both materials. From resource conservation point of view, mechanical recycling has been suggested as the viable option for end-of-life plastic waste management, since it loops materials back directly into new life cycle and reduces primary resource inputs in the production

Removal of pharmaceuticals from WWTP streams by biological and physical processes

Les actuals activitats humanes han comportat la contaminació del medi ambient, la qual cosa ha esdevingut una amenaça global. En concret, l'ineficient eliminació de productes d'ús diari a les plantes de tractament d'aigües residuals (EDARs) es una font de contaminació en si mateixa; especialment quan els llots no tractats i l'aigua resultant són valoritzats en activitats agrícoles. En el present treball s'han desenvolupat dues tècniques de bioremediació amb Trametes versicolor per tal de tractar diferents llots. A més a més, s'ha proposat i estudiat un post-tractament físic per tal d'incrementar la qualitat de l'efluent final d'una EDAR. En tots dos casos, l'eliminació de fàrmacs en cada corrent ha estat avaluada. En la primera secció, es va estudiar l'ús de Trametes versicolor en biopiles a escala de laboratori per tractar llots d'EDAR secs; tot avaluant la seva capacitat per eliminar fàrmacs i l'evolució de les comunitats microbianes. ·Es va escollir un substrat lignocel·lulosic per les biopiles inoculades amb el fong en base a la revisió de dades experimentals publicades i no publicades. ·Es va avaluar l'eliminació total de fàrmacs a concentració real en llots de depuradora tractats en biopiles inoculades i no inoculades amb el fong, provant si la re-inoculació de les biopiles milloraria l'eliminació final. ·L'estudi de les comunitats bacterianes i fúngiques de les biopiles inoculades i no inoculades amb el fong va mostrar que totes dues comunitats van acabar evolucionant cap a poblacions similars. En la segona secció, es va avaluar el creixement i la capacitat per eliminar fàrmacs de Trametes versicolor en llots provinents d'un reactor biològic de membrana (MBR) en sistemes de bioslurry. ·Es va avaluar la capacitat del fong per eliminar compostos en medis líquids dopats, provant diferents medis de cultiu i condicions. ·Es va avaluar l'eliminació d'un gran ventall de fàrmacs per part del fong en bioslurries no estèrils i no dopats. Les anàlisis microbiològics van demostrar un increment de la diversitat microbiana després de 15 dies de tractament. ·Es va incrementar l'escala dels bioslurries de Erlenmeyer a reactor de 5L i el seu corrent de sortida es va digerir anaeròbicament, per tal de comprovar si el tractament amb el fong podia ser re-valoritzat. ·Els resultats finals mostren que Trametes versicolor pot eliminar PPCPs en bioslurry en condicions no esterils. En la tercera secció, es va avaluar l'eliminació de fàrmacs en aigua sintètica mitjançant l'esmena de sòls amb adsorbents de baix cost, per tal de determinar si era posible millorar la qualitat de l'efluent d'una EDAR. ·Es va determinar la capacitat d'adsorció del sòl sense esmenar amb experiments en discontinu de 24h per tal de determinar els coeficients de distribució dels fàrmacs seleccionats. ·Per tal de determinar quina proporció d'esmena seria la mes adequada, es va estudiar l'adsorció en 24h de 3 compostos amb un coeficient octanol/aigua similar en experiments en discontinu. ·Es va mesurar el percentatge d'eliminació de cadascun dels fàrmacs provats per cada esmena de baix cost (biochar i NUA) utilitzada. Els resultats van mostrar alts percentatges d'eliminació per tots els fàrmacs, demostrant l'eficàcia dels adsorbents de baix cost com a esmenes de sòl. Els experiments de les dues primeres seccions es va realitzar al grup d'investigació BioremUAB (Grup de Biodegradació de Contaminants Industrials i Valorització de Residus) del departament d'Enginyeria Química, Biològica i Ambiental de la Universitat Autònoma de Barcelona (UAB). L'objectiu d'aquest grup es el desenvolupament de nous processos biològics pel tractament de contaminants emergents en diferents matrius. Els experiments de l'última secció es van desenvolupar al centre Land & Water del CSIRO. L'objectiu d'aquest centre és el de proporcionar solucions innovadores als complexos desafiaments que sorgeixen de les activitats humanes sobre el medi ambient.Las actuales actividades humanas han conllevado a la contaminación del medio ambiente, lo que se ha convertido en una amenaza global. En concreto, la ineficiente eliminación de productos de uso diario en las plantas de tratamiento de aguas residuales (EDARs) es una fuente de contaminación en sí misma; especialmente cuando los lodos no tratados y el agua resultante son valorizados en actividades agrícolas. En el presente trabajo se han desarrollado dos técnicas de biorremediación con Trametes versicolor para tratar diferentes lodos. Además, se ha propuesto y estudiado un post-tratamiento físico para incrementar la calidad del efluente final de una EDAR. En ambos casos, se ha evaluado la eliminación de fármacos en cada corriente. En la primera sección, se estudió el uso de Trametes versicolor en biopilas a escala de laboratorio para tratar lodos de una EDAR secos; evaluando su capacidad para eliminar fármacos y la evolución de las comunidades microbianas. • Se escogió un sustrato lignocelulósico para las biopilas inoculadas con el hongo en base a datos experimentales publicados y no publicados. • Se evaluó la eliminación total de fármacos a concentración real en lodos de depuradora tratados en biopilas inoculadas y no inoculadas con el hongo, probando si la re-inoculación de las biopilas mejoraría la eliminación final. • El estudio de las comunidades bacterianas y fúngicas de las biopilas inoculadas y no inoculadas con el hongo mostraron que ambas comunidades acabaron evolucionando hacia poblaciones similares. En la segunda sección, se evaluó el crecimiento y la capacidad para eliminar fármacos por parte de Trametes versicolor en lodos provenientes de un reactor biologico de membrana (MBR) en sistemas de bioslurry. • Se evaluó la capacidad del hongo para eliminar compuestos en medios líquidos dopados, probando diferentes medios de cultivo y condiciones. • Se evaluó la eliminación de un amplio número de fármacos por parte del hongo en bioslurries no estériles y no dopados. Los análisis microbiológicos demostraron un incremento de la diversidad microbiana después de 15 días. • Se incrementó la escala de los bioslurries: de Erlenmeyer a reactor de 5L; y su corriente de salida se digerió anaeróbicamente, a fin de comprobar si el tratamiento con el hongo podía ser re-valorizado. • Los resultados finales muestran que Trametes versicolor puede eliminar fármacos en bioslurry en condiciones no estériles. En la tercera sección, se evaluó la eliminación de fármacos en agua sintética mediante la enmienda de suelos con adsorbentes de bajo coste, con el objetivo de determinar si era posible mejorar la calidad de un efluente de EDAR. • Se determinó la capacidad de adsorción del suelo sin enmendar con experimentos en discontinuo de 24h para determinar los coeficientes de distribución de los fármacos seleccionados. • Para determinar qué proporción de enmienda sería la más adecuada, se estudió la adsorción en 24h en experimentos en discontinuo de 3 compuestos con un coeficiente octanol / agua similar. • Se midió el porcentaje de eliminación de cada uno de los fármacos probados por cada enmienda de bajo coste (biochar y NUA) utilizada. Los resultados indicaron altos porcentajes de eliminación para todos los fármacos, demostrando la eficacia de los adsorbentes de bajo coste como enmiendas. Los experimentos de las dos primeras secciones se realizó en el grupo de investigación BioremUAB (Grupo de Biodegradación de Contaminantes Industriales y Valorización de Residuos) del departamento de Ingeniería Química, Biológica y Ambiental de la Universitat Autònoma de Barcelona (UAB). El objetivo de este grupo es el desarrollo de nuevos procesos biológicos para el tratamiento de contaminantes emergentes en diferentes matrices. Los experimentos de la última sección se desarrollaron en el centro Land & Water del CSIRO. El objetivo de este centro es el de proporcionar soluciones innovadoras a los complejos desafíos que surgen de las actividades humanas sobre el medio ambiente.Current human activities have led to the pollution of the environment, which has aroused as a global threat. In particular, the inefficient treatment of every-day products in wastewater treatment plants (WWTPs) is an important source of contaminants; especially when untreated sewage sludge and reclaimed water are valorised for agricultural porpoises. The present work describes the development of two bioremediation processes mediated with Trametes versicolor in order to treat different types of sludge. Additionally, one physical post-treatment has been proposed and studied so as to improve the final quality of a WWTP effluent. In both cases, the removal of pharmaceuticals (PhACs) in each stream has been assessed. In the first section, the use of Trametes versicolor in biopiles at lab scale with dried sewage sludge from the WWTP of El Prat de Llobregat was studied, evaluating its capacity to remove Pharmaceutical and Personal Care Products (PPCPs) and assessing the evolution of the biopiles microbial communities. • Appropriate lignocellulosic substrate for fungal biopiles was selected according to the review of published and unpublished experimental data. • Total removal of drugs at real concentrations from sewage sludge was assessed for non-inoculated and fungal inoculated biopiles, testing if the re-inoculation of the biopiles would improve the removal yields. • The study of the bacterial and fungal communities revealed that fungal inoculated and non-inoculated biopiles evolved to similar communities. In the second section, the growth of Trametes versicolor on Membrane Biological Reactor (MBR) sludge in bioslurry systems was assessed, and its capacity to remove PPCPs was evaluated. • The ability of the fungus to remove a spiked compound in liquid medium cultures was assessed, testing different media and conditions for the bioslurry. • In non-spiked Erlenmeyer fungal bioslurries under non-sterile conditions, the removal of a wide set of PhACs was assessed and microbial analysis were performed, showing that microbial diversity increased after 15 days of treatment. • The fungal bioslurry treatment scale was improved to reactor scale and coupled to an anaerobic digestion process. • Results showed that Trametes versicolor can remove PPCPs in bioslurry systems under non-sterile conditions in matrices as complex as an MBR sludge. In the third section, the efficiency removal of PhACs in synthetic water was assessed in soil amended with low-cost sorbents in order to determine if it was possible to improve the final quality of a WWTP effluent. • The capacity of bare soil to adsorb the PhACs was assessed in 24h batch experiments in order to quantify the distribution coefficient of the drugs. • The adsorption of three drugs with similar octanol/water coefficient at different soil:amendment ratios was assessed and carried out in 24h batch experiments, in order to determine which ratio would be the most suitable. • The removal percentage of each pharmaceutical compound was measured in soil amended with two low-cost sorbents (biochar and NUA) during 21 days. The results showed high removal percentages for all the tested PhACs, proving the efficiency of sorbents to remove emerging pollutants from water by amending the soil. The experiments of the two first sections were performed in the research group BioremUAB (Grup de Biodegradació de Contaminants Industrials i Valorització de Residus) from the Department of Chemical, Biological and Environmental Engineering in Universitat Autònoma de Barcelona (UAB). The aim of this group is the development of novel biological techniques to degrade emerging pollutants in different matrices. The experiments of the last section of this thesis were carried out in the centre Land & Water from the CSIRO. The scope of this centre is to deliver innovative solutions to the complex challenges that arise from the demands and impacts of human activities

Removal of cadmium (II), lead (II) and chromium (VI) in water with nanomaterials

Resumen Un gran desafío para este siglo es el saneamiento de los residuos generados durante las actividades industriales, domésticas y agrícolas. El agua, como parte vital del ciclo de vida, está fuertemente afectada por estas actividades y finalmente se puede volver inutilizable. Entre los numerosos contaminantes que se encuentran en el agua, los metales pesados requieren atención especial ya que no son biodegradables y con frecuencia se acumulan en el medio ambiente causando efectos negativos, tanto a corto plazo como a largo plazo, incluso en bajas concentraciones. Los procesos de adsorción han demostrado ser economicament viables y eficientes en comparación con otras tecnologías, especialmente para la eliminación de contaminantes a partir de soluciones diluidas. Por consiguiente, el desarrollo de nuevos nanomateriales eficientes y de bajo coste para su aplicación en el tratamiento del agua y de las aguas residuales ha sido de gran interés en los últimos años, debido a las propiedades especiales, tales como alta reactividad y fuerte sorción. En este contexto, se ha estudiado la viabilidad de utilizar diferentes nanomateriales para la eliminación de cadmio (II), plomo (II) y cromo (VI) disueltos en agua. Los nanomateriales utilizados podrían agruparse en tres principales grupos: i) las nanopartículas (NPs) de óxidos metálicos (NMOs), óxido de cerio (CeO2), óxido de titanio (TiO2) y óxido de hierro (Fe3O4), ii) polímero, nanopartículas a base de catecol y iii) los nanomateriales con óxido de grafeno (GO) y NPs de CeO2 unidas a óxido de grafeno reducido (RGO). La viabilidad del uso de MNOs para la adsorción de Cd (II) disuelto se puso a prueba y se obtuvieron los parámetros cinéticos y de adsorción. Las NPs de CeO2 también se probaron con diferentes parámetros de funcionamiento, dos pH diferentes y en sistemas uni/multi componentes. Los experimentos de adsorción con las NPs de catecol se realizaron a la par con carbón activado, obteniéndose una mayor capacidad de adsorción con las NPs. También se realizaron ensayos con microorganismos bioluminiscentes y ensayos citotóxicos para evaluar la toxicidad del nanomaterial. Por último, se caracterizaron y utilizaron en procesos de adsorción GO y los nanomateriales CeO2/RGO. El ensamblaje de CeO2 en la superficie del GO siguió dos estrategias diferentes, el crecimiento in situ y el enfoque de auto-ensamblaje. En conclusión, los nanomateriales mostraron resultados prometedores en la eliminación de metales pesados, de esta manera se reafirma una vez más que los nanomateriales pueden ser utilizados como adsorbentes eficaces para el tratamiento de agua y de aguas residualesA great challenge for this century lies in cleaning-up the waste generated during industrial, domestic and agricultural activities. Water, as vital part of the life cycle is heavily affected by these activities and eventually, turns it unusable. Among the numerous contaminants found in water, heavy metals require special attention, as they are non-biodegradable, and often accumulate in the environment causing both short and long term adverse effects, even at low concentrations. The adsorption process proved to be economically feasible and efficient over other technologies, especially for removing pollutants from dilute solutions. In this sense new adsorbents based on nanomaterials are being extensively studied. With this in mind, the development of new, efficient and low cost nanomaterials for their application in water/wastewater has been of great interest in the last years, due to the special properties such as high reactivity and strong sorption. In this framework, the feasibility of using different nanomaterials for the removal of cadmium (II), lead (II) and chromium (VI) dissolved in water has been studied. The nanomaterials used could be grouped into three main groups: i) metal oxides nanoparticles (NMOs), cerium oxide (CeO2) titanium oxide (TiO2) and iron oxide (Fe3O4), ii) polymer, catechol-based nanoparticles (NPs) and iii) graphene oxide (GO)-based nanomaterials, CeO2 NPs attach to reduced graphene oxide (RGO). The viability of using NMOs for the adsorption of dissolved Cd (II) was tested obtaining the adsorption and kinetics parameters. CeO2 NPs also were tested with different operational parameters, two different pH and in single and multicomponent system. The catechol-based NPs adsorption experiments were performed at par with activated carbon, obtaining the higher adsorption capacity with the NPs. Bioluminescent test and cytotoxic assays also were performed in order to assess the toxicity of the nanomaterial. Finally, GO and CeO2/RGO nanomaterials were characterized and tested in adsorption process. The attachment of CeO2 to GO follow two different strategies, in situ-growth and self-assembly approach. In conclusion, nanomaterials showed promising results in the removal of heavy metals, and in this way is reaffirmed once again that nanomaterials can be used as effective adsorbents for water/wastewater treatment

Producció biològica d'hidrogen i energia a partir d'aigües residuals

Investigadors del Departament d'Enginyeria Química de la UAB han aconseguit obtenir energia elèctrica i hidrogen de manera eficient a partir del procés de depuració d'aigües residuals. El sistema proposat utilitza bacteris que consumeixen la matèria orgànica i produeixen un corrent elèctric que permet la producció d'hidrogen, el vector energètic del futur. Els resultats apunten cap a un desenvolupament a escala industrial d'aquesta tecnologia, si bé abans cal afrontar alguns obstacles tècnics.Investigadores del Departamento de Ingeniería Química de la UAB han logrado obtener energía eléctrica e hidrógeno de manera eficiente a partir del proceso de depuración de aguas residuales. El sistema propuesto, publicado en Water Research, utiliza bacterias que consumen la materia orgánica y producen una corriente eléctrica que permite la producción de hidrógeno, el vector energético del futuro. Los resultados apuntan hacia un desarrollo a escala industrial de esta tecnología, si bien antes hay que afrontar algunos obstáculos técnicos.Researchers from the Department of Chemical Engineering at the UAB have managed to produce electrical energy and hydrogen efficiently from the sewage treatment process. The proposed system, published in Water Research, uses bacteria which consume organic matter and produce electric current, thereby enabling the production of hydrogen, the energy of the future. The results point to an industrial scale development of this technology, although some technical obstacles must be overcome first

L'Increment de la dosi gènica com a estratègia de millora de la producció de proteïnes recombinants al llevat Pichia pastoris : revertint les limitacions genètiques del sistema biològic /

BibliografiaLa producció de proteïnes recombinants ha esdevingut la opció predilecta per la producció de productes biofarmacèutics i enzims industrials. Com a factories cel·lulars, els llevats presenten nombroses avantatges enfront d'altres microorganismes, com la seva capacitat per realitzar modificacions post-traduccionals a les proteïnes, l'ampli ventall d'eines genètiques i la facilitat per créixer a altes densitats, entre d'altres. En aquest context, la idoneïtat del llevat metilotròfic Pichia pastoris en la producció de proteïnes recombinants ha destacat per sobre del llevat clàssic Saccharomyces cerevisiae, presentant una rellevància creixent en la producció de productes comercials recombinants. Entre d'altres factors, la presència del promotor AOX1 (PAOX1), d'expressió elevada i fortament regulat pel metanol, ha contribuït a la popularitat d'aquest sistema d'expressió. Per tal de millorar la producció de proteïna recombinant, s'han provat diverses estratègies, sent l'increment de la dosi gènica una de les més populars. Tot i que es pot obtenir una millora de la productivitat heteròloga amb aquesta metodologia, elevades dosis gèniques normalment comporten una sobrecàrrega metabòlica que deriva en productivitats baixes. Durant el transcurs d'aquesta tesi, s'ha utilitzat la lipasa de Rhizopus oryzae (Rol) com a proteïna model, expressada sota el control de PAOX1. Primer, es va construir una col·lecció de soques de P. pastoris amb un nombre creixent de còpies de ROL, i es va descriure per primer cop l'ús de la ddPCR (de l'anglès Droplet Digital PCR) per la determinació acurada de la dosi gènica a P. pastoris, demostrant una precisió més elevada que amb l'ús de la qPCR (de l'anglès quantitative real-time PCR) convencional. Segon, es va realitzar un estudi transcriptòmic mitjançant microarrays d'un grup de soques multicòpia, per tal d'entendre millor l'impacte de la dosi gènica de ROL a les rutes metabòliques. Concretament, les dades van revelar una forta regulació negativa de les rutes relacionades amb el metanol (entre d'altres), en consonància amb les dades fisiològiques obtingudes, que mostraven que les taxes de consum de la font de carboni i el creixement cel·lular eren dependents del nombre de còpies. A partir d'aquestes observacions, es va modificar una soca amb 4 còpies de ROL per tal que expressés una variant desregulada del factor de transcripció Mxr1, principal regulador de la ruta del metanol. Les dades fisiològiques i els nivells transcripcionals dels principals gens implicats en el metabolisme del metanol van confirmar la millora en la producció de Rol i l'increment en l'expressió dels gens relacionats amb el metanol i ROL. Finalment, es va dur a terme un estudi comparatiu a nivell transcriptòmic de la resposta de P. pastoris a l'expressió de tres proteïnes recombinants diferents, per tal d'estudiar l'impacte de la complexitat proteica i l'ús de sistemes d'expressió constitutius o induïbles. En resum, el present estudi descriu per primera vegada una aproximació a nivell de sistema de l'impacte d'una dosi gènica creixent en el llevat P. pastoris, permetent així el disseny de noves estratègies d'enginyeria cel·lular per tal de generar soques més productores, mitjançant la biologia sintètica i l'enginyeria metabòlica.Recombinant protein production is becoming the preferred option to synthesized biopharmaceutical and industrial enzymes. As a host system, yeast factories provide numerous advantages over other microorganisms, such as their capacity to perform post-translational protein modifications, the wide genetic available tools, and the facility to growth at high densities, among others. In this context, the suitability of methylotrophic yeast Pichia pastoris for recombinant protein production has stand out over the classical yeast Saccharomyces cerevisiae, presenting an increasing relevance for the production of commercial recombinant products. Among several factors, the presence of the strong and tightly regulated AOX1 promoter (PAOX1) has contributed to the popularity of this expression system. To further increase the recombinant protein production, several strategies have been attempted, being the increase of the heterologous gene dosage one of the most widely reported. Although a heterologous productivity improvement can be achieved with this methodology, high gene dosages normally entail a metabolic burden in the cell that results in lower productivities. In the course of this thesis, it has been used the lipase of Rhizopus oryzae (Rol) as a protein model expressed under the control of the PAOX1. Firstly, we constructed a series of P. pastoris strains harbouring an increase gene dosage of ROL, and we reported for the first time the use of Droplet Digital PCR (ddPCR) for an accurate copy number determination in P. pastoris, allowing a higher precision than using conventional quantitative real-time PCR (qPCR). Secondly, a transcriptomic study of a set of multicopy strains was carried out using microarrays, to better understand the impact of ROL gene dosage on the metabolic pathways. Concretely, transcriptomic data revealed a high downregulation of methanol-related pathways (among others), in agreement with the physiological data that had been showed that C-source uptake rate and growth yields were gene dosage dependents. Based on these observations, a strain carrying 4 copies of ROL was remodified to express a deregulated variant of the Mxr1 transcription factor, the main regulator of methanol metabolism. Physiological data and transcriptional levels of the main genes involved in methanol metabolism confirmed the improvement of Rol production and the increasing expression levels of methanol-related genes and ROL. Finally, it was performed a comparative transcriptomic analysis of the response of P. pastoris to the expression of three different recombinant proteins, to study the impact of protein complexity and the use of constitutive or inducible expression systems. Overall, in the present study we describe the first systems-level approach to determine the impact of increasing gene dosage in the yeast P. pastoris, hence allowing the design of novel cell engineering strategies to generate high-producing strains by means of the synthetic biology and metabolic engineering